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如何構(gòu)建過表達(dá)載體？（分子生物學(xué)）

2022-09-10 20:32

2個(gè)回答

2022-09-11 01:14

1 可以用酶切連接法（傳統(tǒng)），也就是將目的基因和載體都用相同的限制性酶（或同尾酶）酶切，然后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽性克??；
2 重組法，利用同源重組將外源基因整合到表達(dá)載體，外源基因可以先聯(lián)到一個(gè)含重組位點(diǎn)的中間載體，然后用重組酶將其置換到表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞，篩選出陽性克隆

2022-09-10 23:46

第一種方式即將基因和可以表達(dá)的載體如PET，PGEX等酶切后直接連接，再轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞
第二種即將基因先和克隆載體如PMD連接，再將構(gòu)建成功的克隆載體和PET等表達(dá)載體，酶切后連接，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，這種情況針對(duì)，直接PCR產(chǎn)物連不上的情況

相關(guān)問答

如何構(gòu)建一個(gè)基因的過表達(dá)載體

1個(gè)回答2022-08-28 03:42

用限制酶分別切割目的基因兩側(cè)及運(yùn)載體，然后在DNA連接酶的作用下就形成了基因表達(dá)載體。

為什么要先構(gòu)建克隆載體再用表達(dá)載體

2個(gè)回答2023-02-22 22:55

你最早的目的基因、質(zhì)粒什么的都是拿去公司合成的，很少量，所以要先克隆，把它變多，再做實(shí)驗(yàn)，去表達(dá)

將目的基因構(gòu)建在表達(dá)載體上的方法有哪些

1個(gè)回答2023-01-08 02:24

有兩種常用的方法。第一種是直接將PCR擴(kuò)增的基因片段酶切，然后連接到酶切過的表達(dá)載體上。第二種是先把PCR產(chǎn)物連到過度載體上，再從過度載體搶切下目的基因，最后再連接到酶切過的表達(dá)載體上。

為什么構(gòu)建的真核表達(dá)載體在真核細(xì)胞中不表達(dá)

2個(gè)回答2022-09-22 22:55

有的時(shí)候在不同的表達(dá)體系里面對(duì)蛋白的表達(dá)量是有影響的。當(dāng)構(gòu)建完成后攜帶有信號(hào)肽的時(shí)候，一些蛋白在真核表達(dá)體系中表達(dá)量極低。去除信號(hào)肽序列值后，直接表達(dá)成熟肽，表達(dá)水平明顯提高。所以說構(gòu)建的真核表達(dá)載體...

全文

質(zhì)粒載體如何構(gòu)建

3個(gè)回答2022-09-07 05:22

首先需要一個(gè)表達(dá)載體，看你需要原核還是真核，看情況選擇，然后有獲得你需要的目的基因，在兩端加酶切位點(diǎn)，將目的基因與載體連接到一起后就完成了質(zhì)粒載體的構(gòu)建了。

表達(dá)載體的構(gòu)建中目的片段與表達(dá)載體的連接最好是幾個(gè)小時(shí)？時(shí)間長一點(diǎn)有什么影響么？

1個(gè)回答2023-01-30 20:36

最好是12h左右，按說應(yīng)該是時(shí)間越長越好，會(huì)有更多的DNA連接，但考慮到DNA的穩(wěn)定性，還是12h左右較好

為什么我構(gòu)建的真核表達(dá)載體高表達(dá)mRNA卻檢測(cè)不到目的蛋白

1個(gè)回答2022-09-19 15:25

全文

構(gòu)建的原核表達(dá)載體，測(cè)序也正確，為什么有的就不表達(dá)目的蛋白？

3個(gè)回答2022-09-13 19:01